生化分析儀的正確應(yīng)用，只是掌握了測(cè)定技術(shù)原理還不夠，還需要對(duì)具體儀器的工作流程及測(cè)定計(jì)算方法有足夠的了解。   

(一)一般工作流程

工作流程可以通過(guò)儀器的測(cè)定周期來(lái)考察。重點(diǎn)關(guān)注比色杯空白讀數(shù)點(diǎn)(CB)、加樣品點(diǎn)（S）、各試劑加液點(diǎn)(R1、R2、……)、試劑空白讀數(shù)點(diǎn)(RB)、各測(cè)定讀數(shù)點(diǎn)(P)、各點(diǎn)時(shí)間間隔及周期總時(shí)間等。每個(gè)儀器一般都在反應(yīng)轉(zhuǎn)盤的固定位置和反應(yīng)測(cè)定周期的固定時(shí)間設(shè)置樣品試劑和稀釋的加液位，以及測(cè)定讀數(shù)點(diǎn)。如HITACHI 7170在P1到P34周期為10分鐘時(shí)，PO前加樣品，Rl在Pl前，R2在P5和P6間，R3在P16和P17間，R4在：P33和P34間。

(二)數(shù)據(jù)處理計(jì)算方法

儀器在各個(gè)吸光度讀數(shù)點(diǎn)讀取的吸光度數(shù)據(jù)，并不一定都納人濃度計(jì)算。儀器往往根據(jù)儀器定義和操作者設(shè)定的要求，對(duì)吸光度原始數(shù)據(jù)作計(jì)算處理，轉(zhuǎn)換成所謂反應(yīng)數(shù)據(jù)，再按系數(shù)或公式作濃度計(jì)算。舉例如下：

1．HITACH 7170的終點(diǎn)法測(cè)定點(diǎn)(A )吸光度計(jì)算為(AX+AX－1)／2。實(shí)際吸光度=吸光度數(shù)據(jù)×10 000。

2．0LYHPUS AU 600試劑空白數(shù)據(jù)：P0點(diǎn)試劑空白(RB)=P0點(diǎn)吸光度一比色杯水空白(wB)；任一測(cè)定點(diǎn)試劑空白(RB )。該點(diǎn)吸光度一比色杯水空白(WB)。

3．Monarch 1 000兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)數(shù)據(jù)。(終點(diǎn)測(cè)定吸光度一終點(diǎn)空白吸光度)一(始點(diǎn)測(cè)定吸光度一始點(diǎn)空白吸光度)。

4．AU 600的終點(diǎn)法(帶試劑空白，END法)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度一P0點(diǎn)吸光度(試劑空白，RB)。終點(diǎn)法(不帶試劑空白，END)．法)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=終點(diǎn)吸光度-比色杯水空白(WB)。

5．Au 600的兩點(diǎn)法(自身空白)的反應(yīng)數(shù)據(jù)=[加第二試劑后測(cè)定點(diǎn)讀數(shù)一P0點(diǎn)讀數(shù)]一[加第二試劑前測(cè)定點(diǎn)讀數(shù)一PO點(diǎn)讀數(shù)]。

三、主要操作程序

(一)儀器運(yùn)行前操作程序

主要進(jìn)行儀器的基本設(shè)置：

l．試驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置對(duì)試驗(yàn)名稱、編碼，試驗(yàn)組合(Profile)、試驗(yàn)輪次(Round)，必要時(shí)包括試驗(yàn)順序等設(shè)置。  

2．各試驗(yàn)的參數(shù)設(shè)置包括試驗(yàn)間比值、結(jié)果核對(duì)等參數(shù)的設(shè)定。

3．劑設(shè)置根據(jù)有關(guān)試驗(yàn)參數(shù)，設(shè)置各試驗(yàn)的試劑位、試劑瓶規(guī)格，必要時(shí)設(shè)定試劑批號(hào)、失效期等。

4．校準(zhǔn)品設(shè)置對(duì)校準(zhǔn)品的位置、濃度和數(shù)量等進(jìn)行設(shè)置。

5．質(zhì)控設(shè)置 根據(jù)質(zhì)控要求。設(shè)置質(zhì)控物個(gè)數(shù)，質(zhì)控規(guī)則，質(zhì)控項(xiàng)目及相應(yīng)質(zhì)控參數(shù)等。

6．樣品管設(shè)置 包括樣品管類型，殘留液高度（死體積），識(shí)別方式等設(shè)置。

7．其他設(shè)置對(duì)數(shù)據(jù)傳輸方式、結(jié)果報(bào)告格式、復(fù)查方式及復(fù)查標(biāo)準(zhǔn)等設(shè)置。

(二)常規(guī)操作程序

開機(jī)(預(yù)熱、保養(yǎng))-設(shè)置開始條件(日期時(shí)間索引、輪次、樣品起始號(hào)等)-根據(jù)需要，申請(qǐng)校準(zhǔn)、質(zhì)控和病人測(cè)定項(xiàng)目(包括架號(hào)、杯號(hào)或順序號(hào)。測(cè)定中可繼續(xù)申請(qǐng))_裝載校準(zhǔn)品、質(zhì)控物和病人標(biāo)本-裝載試劑-核對(duì)儀器起始狀態(tài)（未應(yīng)用條碼系統(tǒng)，采用順序識(shí)別樣品時(shí)，尤其要核對(duì)測(cè)定起始編號(hào)是否與樣品架號(hào)和申請(qǐng)?zhí)栂喾?定標(biāo)和質(zhì)控測(cè)定-檢查定標(biāo)和質(zhì)控結(jié)果-病人標(biāo)本測(cè)定-測(cè)定過(guò)程監(jiān)控（試劑檢查，觀察分析結(jié)果，編輯校正）-數(shù)據(jù)傳遞（打印報(bào)告，向檢驗(yàn)管理系統(tǒng)傳輸，包括工作量統(tǒng)計(jì)、財(cái)務(wù)統(tǒng)計(jì)、病人情況追蹤、質(zhì)控分析等)。測(cè)定后保養(yǎng)。

(三)測(cè)定結(jié)果檢查分析

1．要了解和熟悉儀器的各種警示符號(hào)的含義與作用在正確設(shè)定參數(shù)的前提下，利用各種警示符能提高我們發(fā)現(xiàn)問(wèn)題和解決問(wèn)題的效率。

2．要熟悉和靈活運(yùn)用儀器的相關(guān)操作屏(界面) 如：用反應(yīng)過(guò)程監(jiān)測(cè)(Reaction Monitor)，觀察反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線；用校準(zhǔn)追蹤(Calibration Trace)回顧分析校準(zhǔn)曲線；利用統(tǒng)計(jì)(Statistics)了解不同日期段病人測(cè)定均值及數(shù)據(jù)分析；運(yùn)用分析數(shù)據(jù)編輯(Data Edit)察看和校正測(cè)定數(shù)據(jù)。

3．校準(zhǔn)的檢查要充分利用儀器設(shè)置的功能，監(jiān)測(cè)校準(zhǔn)曲線圖形、各校準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值(不能忽略試劑空白值及空白速率值)、計(jì)算K值等的波動(dòng)情況，以及與以往的比較。必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步檢查反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線。必須結(jié)合質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)來(lái)把握實(shí)驗(yàn)條件。

4．病人結(jié)果的檢查除了目測(cè)觀察或用血清指數(shù)了解標(biāo)本性狀，注意和了解臨床資料及診斷外，學(xué)會(huì)分析反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線及數(shù)據(jù)是重要的基本功。

四、基本測(cè)定方法   

(一)終點(diǎn)法(End point method)   

根據(jù)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。對(duì)一般化學(xué)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，反應(yīng)完全(或正、逆反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡)、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)。對(duì)抗原一抗體反應(yīng)來(lái)說(shuō)，是抗原和抗體完全反應(yīng)、形成最大且穩(wěn)定的免疫復(fù)合物時(shí)為終點(diǎn)。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為與x軸平行線區(qū)段。在測(cè)定計(jì)算方式上，一般分為一點(diǎn)法和兩點(diǎn)法兩種。

1．一點(diǎn)法(One Point) 以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB)、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測(cè)定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，得到反應(yīng)吸光度。通過(guò)與相同條件下校準(zhǔn)液反應(yīng)吸光度的比較，求得測(cè)定結(jié)果。常與一點(diǎn)校準(zhǔn)法配合使用，即采用一個(gè)校準(zhǔn)濃度，校準(zhǔn)曲線通過(guò)零點(diǎn)且成線性。也應(yīng)用多點(diǎn)校準(zhǔn)。

2．兩點(diǎn)終點(diǎn)法(Two Point End)即終點(diǎn)一始點(diǎn)法 以試劑和樣品混合之后的某一時(shí)間點(diǎn)作為始點(diǎn)，以反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度讀數(shù)減去始點(diǎn)讀數(shù)。一定條件下可降低樣品對(duì)反應(yīng)或反應(yīng)本身的特異性于擾(主要指色度干擾)。常采用雙試劑，多以加R2前某一點(diǎn)作測(cè)定始點(diǎn)；某些情況下，也可以加R2后一點(diǎn)作測(cè)定始點(diǎn)。若使用單試劑，主反應(yīng)啟動(dòng)太快或儀器起始讀數(shù)點(diǎn)受限時(shí)難以運(yùn)用。

固定時(shí)間法(Fixed Method)與兩點(diǎn)終點(diǎn)法的區(qū)別只是在：測(cè)定讀數(shù)的末點(diǎn)不在反應(yīng)平衡區(qū)段，而是根據(jù)方法學(xué)選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測(cè)定。

3．三點(diǎn)終點(diǎn)法 即雙終點(diǎn)法，在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測(cè)定。比如同測(cè)游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法。

(二)連續(xù)監(jiān)測(cè)法(Continuous monitoring method)

又稱速率法(Rate Assay)。即連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，根據(jù)所測(cè)定的產(chǎn)物生成或底物消耗的速度進(jìn)行定量分析的方法。在反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線上為反應(yīng)呈恒速區(qū)段(斜率保持不變)，常用于酶活性線性反應(yīng)期測(cè)定。

1．連續(xù)監(jiān)測(cè)法即零級(jí)反應(yīng)速率法，亦稱斜率法。在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)(至少90-120秒)，每隔一定時(shí)間(常為2~30秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點(diǎn)，得到3個(gè)△A；一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理，讀數(shù)間隔時(shí)間太短的作帶速率時(shí)間(TR)多點(diǎn)法處理，均取線性反應(yīng)部分的讀數(shù)，求出單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率△A/min。此法必須以零級(jí)反應(yīng)為測(cè)定計(jì)算的基礎(chǔ)，因?yàn)橹挥性诹慵?jí)反應(yīng)下，單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率△A/min)才與酶活力呈正比。此法相對(duì)減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性。但是，半自動(dòng)生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測(cè)，相當(dāng)耗時(shí)。應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，首先應(yīng)準(zhǔn)備線性范圍內(nèi)的高、中、低濃度的樣品，分別作反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線，了解不同濃度下反應(yīng)全過(guò)程，兼顧確定延遲時(shí)間和線性監(jiān)測(cè)期。

2．兩點(diǎn)速率法即所謂擬一級(jí)速率法。在反應(yīng)中選取兩時(shí)問(wèn)點(diǎn)t 1、t 2，讀取吸光度A 1、A2，計(jì)算(A2-A1)，(t2-t1)=△A，△t。此方法與終點(diǎn)兩點(diǎn)法的區(qū)別主要有兩點(diǎn)：后一讀數(shù)點(diǎn)反應(yīng)未達(dá)終點(diǎn)，以速率計(jì)算結(jié)果。它與連續(xù)監(jiān)測(cè)法比較，缺點(diǎn)在于人為確定t 1、t 2，不定因素較多，不能保證反應(yīng)在t 1-t 2期間呈線性，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)在常規(guī)測(cè)定前，先做預(yù)試驗(yàn)來(lái)確定線性時(shí)間段。若在選擇的時(shí)間段內(nèi)反應(yīng)不成線性(如零級(jí)反應(yīng)期短，儀器無(wú)法設(shè)置或測(cè)定)，則只能改用終點(diǎn)法。優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)單；酶活力較低、測(cè)定吸光度值較小時(shí)，可增加測(cè)定時(shí)間段而不受儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的局限，減少讀數(shù)誤差。

3．速率B法在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的速率法測(cè)定。它既可以是兩項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定，也可用于干擾或／及樣品空白自動(dòng)補(bǔ)償0后一用途的原理是：利用儀器的微機(jī)自動(dòng)處理，在第一反應(yīng)(干擾反應(yīng))一直維持線性的前提下，可以從第二反應(yīng)(主反應(yīng))速率中扣除第一反應(yīng)速率的延續(xù)影響。如用于消除膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素吸光度下降、對(duì)肌酐苦味酸法測(cè)定的負(fù)干擾等。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法。

(三)空白(blank)校正

在分光光度法中，常利用空白溶液來(lái)調(diào)節(jié)儀器的吸光度零點(diǎn)，或用來(lái)抵消某些測(cè)定的干擾因素。在生化分析儀測(cè)定中，除了采用雙或多波長(zhǎng)、兩點(diǎn)法等排除背景干擾外，常要運(yùn)用專門空白測(cè)定，以便從樣品測(cè)定吸光度中扣除其影響。正確選擇空白校正，對(duì)提高準(zhǔn)確度起重要作用。

1．試劑空白一般在方法類型和校準(zhǔn)模式中，即分為有或無(wú)試劑空白兩大類。試劑空白單獨(dú)測(cè)定或與校準(zhǔn)配合測(cè)定，并需預(yù)選裝載去離子水樣品杯或試劑空白架。校準(zhǔn)或病人樣品的各測(cè)定點(diǎn)吸光度，均要扣除相應(yīng)測(cè)定點(diǎn)的試劑空白吸光度或空白速率值。無(wú)試劑空白的方法，多直接以反應(yīng)杯的水空白作為測(cè)定基準(zhǔn)值。

在不少儀器中，試劑空白測(cè)定類似校準(zhǔn)測(cè)定，并非在病人樣品測(cè)定時(shí)實(shí)時(shí)測(cè)定。所以，要注意它的測(cè)定頻率，避免因試劑批號(hào)或質(zhì)量的變化造成試劑空白的改變引起的計(jì)算誤差。

2.樣品空白 主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法，測(cè)定校正結(jié)果=顯色反應(yīng)通道結(jié)果-空白通道結(jié)果。多數(shù)儀器須另外占用測(cè)定通道，分析速度減半，但去干擾的準(zhǔn)確性應(yīng)高于兩點(diǎn)終點(diǎn)